Abstract:
Study of nitric oxide (NO) production during experimental infection with toxoplasma gondii toxoplasma is a parasite of cosmopolitian distribution , able develop in a wide variety of vertebrate hosts. The aim of the present experiment was to study for production of nitric oxide (NO) during infection with Toxoplasma gondii. chickens were infected by administering the various dosages (0 cyst until 30 cysts) of parasite in 1-5 aqueous suspensions. NO production was estimated by Griess reaction. The results shows NO production increased after administration of variouse toxoplasma cysts. During infection chicknes synthesize large quantities of NO; while the rate of production of NO was differents in an acute case in compartion with choronic one. These results suggest that NO may play an important part in controling of choronic toxoplasmosis in chickens.
key words: toxoplasma , nitric oxide , chickens

1- Khorasgan(Golpayegan) Azad Univesity
2- Isfahan Medicine University
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
<

Toxoplasma gondii انگل اجباری درون ياخته ای هسته دار است که  طيف گسترده ای از پستانداران ، پرندگان و خزندگان ، ميزبان واسط آن هستند. گزارشهای متعدد نشان  می دهد  آلودگی  ميزبان  پستاندار  به  انگل توکسوپلاسما موجب واکنشهای پی در پی  ايمنی می شود که از توليد اينترلوکين ۱۲  آغاز شده و  پس از فعال شدن اينترفرون گاما  و  توليد  فاکتور نکروزدهنده تومور (TNFa) منجر  به  توليد  آنزيم  سنتز  کننده  نيتريک اکسايد(iNOS)می شود و نيتريک اکسايد (NO)احتمالا اثر سمی بر انگل می گذارد.NO در بدن نقشهای گوناگون دارد. از فعاليتهای فيزيولوژيک تا پاتولوژيک NO راديکال آزاد گازی شکلی است که اثر خود را عمدتا از طريق شکل دهی cGMP نشان مي دهد. در اين ميان، ماکيان نيز به توکسوپلاسموز مبتلا می شوند، اما تا کنون مطالعات زيادی پيرامون چگونگی واکنش ماکيان عليه اين انگل گزارش نشده است. اين در حالی است که بيماری حاد ناشی از توکسوپلاسما در پرندگان با مرگ همراه است و قبل از مرگ علايمی همچون برگشتگی سر ،لرزيدن بدن و عدم تعادل در پرنده به چشم می خورد. از لحاظ تحقيقات اپيدميولوژی وجود اين انگل در ماکيان ايران به اثبات رسيده است. تحقيقات نشان داد، بسياری از ماکيان ايران به انگل آلوده اند.در يک بررسی وجود آنتی بادی عليه توکسوپلاسما را در مرغان تخمگذار و مادر ، در استان اصفهان گزارش کردند.
اهداف اصلی از انجام اينطرح عبارت بودند از: بررسی نوع دفاع ايمنولوژيک مرغان عليه عفونتهای داخل سلولی و مقايسه آن با پستانداران ، راه اندازی شيوه اندازهگيری متابوليتهای پايدار نيتريک اکسايد در مايعات بيولوژيک.
مواد و روش ها :
تعداد ۵۰قطعه نيمچه تخمگذار تجاری با ميانگين سنی (۱±۱۴) هفته انتخاب شدند. نيمچه ها از نظر آلودگی به انگل توکسوپلاسما از طريق آزمايش هم آگلوتيناسيون غير مستقيم (IHA) بررسی شدند که همگی سالم بودند. نيمچه ها در طول آزمايش در قفسهايی با ظرفيت ۵ عدد نگهداری می شدند. جيره غذايی آنها بر اساس توصيه  (۱۹۹۴) NRC و توسط متخصص تغذيه مرغداری تهيه شد. آب بطور آزاد در اختيار مرغان قرار داشت. در طول آزمايش دمای محيط و شرايط نوری با توجه به شرايط سنی مرغان تنظيم بود. زمان انجام آزمايش تابستان ۱۳۸۱ بود.سويه ME-49 انگل (به عنوان سويه ايی که در بسياری از تحقيقات کاربرد دارد و توسط شرکت توليد کننده از سلولهای اپی تليال روده گربه تهيه می شود) خريداری شد. اين سويه ها قبل از تزريق تخفيف حدت داده شدند. به اين ترتيب که سويه ها به صورت داخل ديافراگمی (IP) به موشهای سفيد آزمايشگاهی تزريق شد.۳-۴ هفته بعد موشها به وسيله اتر کشته شدند و سوسپانسيون هموژن مغز آنها تهيه شد. سوسپانسيونها بهشيوه ای تقسيم بندی شدند که هر ۱ ميلی ليتر از آنها حداقل ۱۰۰ سيست انگل قابل شناسايی بود. سپس بر اساس تيمارهای طراحی شده به گروه های مختلف نيمچه ها تزريق انجام شد.
مجموعا ۱۰ قفس وجود داشت ، بنابراين هر تيمار به ۲ قفس اعمال شد . تيمارها عبارت بودند از :
(۱)گروه شاهد; تزريق cc ۰/۵ از سوسپانسيون (صفر سيست)
(۲)تيمار اول;تزريق cc ۰/۱ از سوسپانسيون(۱۰ سيست)
(۳)تيمار دوم;تزريق cc ۰/۲ از سوسپانسيون(۲۰ سيست)
(۴)تيمار سوم;تزريق cc ۰/۳ از سوسپانسيون(۳۰ سيست)
(۵)تيمار چهارم;تزريق cc ۰/۵ از سوسپانسيون(۵۰ سيست)
نمونه گيری خون در ۳ نوبت پس از آلوده نمودن نيمچه ها (روز ۸،۴و۱۲) انجام شد. خونگيری به ميزان ۵cc و از طريق سياهرگ بالی پرنده بعمل آمد. برای خونگيری از لوله های آزمايش حاوی EDTA استفاده شد. دمای نمونه های تهيه شده سريعا بوسيله يخ کاهش يافت و سپس در ساعت نخست نمونه گيری سانتريفوژ شد تا پلاسما به دست آيد. پلاسما تا زمان انجام آزمايش در دمای ۲۲-˚C نگهداری می شد.
NO گازی بسيار ناپيدار است که سريعا به متابوليتهای پايدار خود NO₂ وNO₃ تبديل می شود. اساس اندازه گيری بر اساس استفاده از معرف گريس (Greiss)بود. اين معرف مخلوطی است از (نفتالين دی هيدروکلرايد ۱/۰٪ ، سولفانيلاميد ۱٪ و اسيد فسفريک ۵/۲٪)که از شرکت Sigma تهيه شد.۵۰ ميکروليتر از پلاسما به دست آمده با ۵۰ ميکروليتر از محلول گريس در گوده های پليت مخلوط گرديد. ۱۵ دقيقه در دمای اتاق اينکوبه شد و سپس توسط ELISA-Reader از نوع Statax303،جذب نوری در طول موج ۵۴۰ نانومتر با طول موج رفرنس ۶۳۰ نانومتر قرائت شد. معرف گريس قادر به اندازه گيری NO₃(نيترات) نمی باشد. به همين دليل از گرانولهای عنصر کادميم (Cd) که توانائی احيای نيترات را دارد استفاده شد. به ازای هر نمونهgr۰/۵ کادميم شسته شده با آب مقطر ،HCI (مولار ۱/۰)و NH₄OH (مولار ۱/۰) به گوده ها اضافه شد. برای کاهش اثرات متقابل پرتئين بالا در پلاسما نيز از محلول سولفات روی به ميزان ۱۰cc استفاده شد. جهت استاندارد کردن دستگاه از NaNO2 استفاده شد. ابتدا ۴ نوع استاندارد با غلظتهای ۵μM و ۱۰μM و ۲۵μM و ۵۰μM تهيه و استفاده شد. منحنی استاندارد به دست آمده به صورت خط راست و قابل پذيرش بود. مجموع NO2+NO3 شاخصی برای ميزان توليد NO در نظر گرفته شد. داده های به دست آمده بوسيله تهيه جدول ANOVA و به کمک نرم افزار آماری SAS مورد بررسی قرار گرفت. اختلافهای معنی دار بين گروههای بوسيله آزمون دانکن در سطح (0.05≤p)بررسی شد.

ميزان نيتريک اکسايد توليدی با آلوده شدن مرغان به سيست توکسوپلاسما افزايش می يابد.اين افزايش توليد در هنگاميکه تعداد سيست ۵۰ عدد باشد در ۴ روز پس از تزريق انگل نسبت به ساير تيمارها کاملا معنی دار است (P≤0.05). افزايش روند توليد NO در تيمار چهارم تا روز هشتم ادامه يافت. اما ۱۲ روز پس از تزريق ، مقدار توليد NO در اين گروه کاهش يافت. در ساير تيمارها افزايش محسوس توليد NO ديده شد. ميزان توليد NO در تيمار سوم (۳۰ سيست تزريقی)، ۸ روز پس از تزريق ، نسبت به گروه اول و دوم تفاوت معنی داری را نشان داد و به مراتب بيشتر از آنها بود.اين تيمار در روز ۱۲ پس از تزريق انگلها همچنان رو به افزايش بود. تحقيقات قبلی نشان داده است که پستانداران در عفونتهای داخل سلولی مقدار زيادی نيتريک اکسايد توليد می کنند. مهمترين منبع ترشحی NO در آنها ماکروفاژها می باشند. اما تحقيقات زيادی در مورد پرندگان انجام نشده است. فعاليت آنزيم سنتز کننده NO و بيان mRNA مربوط به آن در ماکروفاژ طيور در سال ۱۹۹۷ گزارش شد. اما اشاره ای به عفونتهای داخل ماکروفاژها و ميزان توليد NO نشده است. در سال ۱۹۹۹ به توانایی ماکروفاژهای( HD₁₁ ) مرغان جهت توليد NO تاکيد ورزيد و اشاره نمود تبديل شدن ال سيترولين به ال آرژنين در اين دسته از ماکروفاژها رخ می دهد و منجر به توليد نيتريک اکسايد می شود. Allen در سال ۱۹۹۷ مشخص نمود نيتريک اکسايد در زمان آلودگی جوجه ها به Eimeria tenella افزايش می يابد. توکسوپلاسما پس از ورود به بدن توسط ماکروفاژها بلعيده می شود. بنابراين سلولهای Tسايتوليتيک، توانايی از بين بردن آنرا ندارد . در پستانداران مشخص شده است ، iNOS به عنوان آنزيم سنتز کننده NO توانايی ظهور در شرايط حاد دفاع ايمنولوژيک را ندارد. به عبارتی iNOS تنها در عفونتهای مزمن واجد اهميت است. نتايج اين تحقيق نيز چنين موضوعی را در مورد ماکيان تاييد می کند. ايجاد شرايط مزمن بيماری(با حداکثر ۵۰ سيست) ميزان توليد NO را افزايش داد. اما هنگاميکه بيماری از لحاظ کلينيکی علايم خود را بروز داد و شرايط حاد را در پيش گرفت (تيمار چهارم) ميزان توليد NO کاهش يافت. که اين خود مويد کاهش فعاليت iNOS در اين دسته از مرغان بود. در مجموع نتايج اين تحقيق نشان داد، همانند پستانداران سيستم ايمنی مرغان توانايی توليد نيتريک اکسايد را دارد و از NO علاوه بر يک ميانجی فيزيولوژيک ، به عنوان ترکيب ايمنولوژيک نيز بهره برداری می شود. پيشنهاد می شود در نژادهای بومی مرغان ايرانی و در شرايط In Vitro ميزان توليد NO توسط ماکروفاژهای آنان بررسی و با ساير مرغان مقايسه گردد.