1- كارشناسان ارشد پژوهشي ژنتيك و اصلاح نژاد مركز تحقيقات كشاورزي آذربايجان شرقي
2- عضو هيات علمي دانشگاه فردوسي مشهد

چكيده:
امروزه براي شناسائي جهشهاي موجود در سطح ژنوم پستانداران مي توان از تكنيكهاي مختلفي همچون روشهاي مبتي بر PCR از جمله Microsatellite، SSCP، AFLP، RFLP، DGGE و ARMS استفاده نمود. اين تكنيكها عمدتا براي نقشه يابي ژنها، تشخيص ژنوتيپهاي مختلف يك ژن مطلوب و همچينين مطالعات جمعيتي و آزمون انساب استفاده مي شود. مزيت انكارناپذير اين تكنيكها، تجريه و تحليل سريع اطلاعات ژنوم در يك جمعيت با استفاده از مقادير بسيار ناچيزي از DNA مي باشد. بنابراين در قدم اول نياز به استفاده از يك روش استخراج DNA كه سريع و بي خطر و مقرون به صرفه باشد، همواره احساس مي شود. چندين روش مختلف به منظور حداقل كردن مراحل استخراج DNA ، توسط محققان مختلف گزارش شده است. در اين تحقيق اقدام به مقايسه روشهاي مختلف استخراج DNA از خون، شير، ريشه مو، اسپرم گرديد. كيفيت و كميت استخراج با دو روش اسپكتوفتومتري و ژل مونتيورينگ مشخص شد. و در نهايت براي ارزيابي كيفيت DNA استخراج شده ، انجام تكنيكهاي (RAPD) با استفاده از آغازگر تصادفيOPU13 و RFLP با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي 24 جفت بازي طراحي شده براي تكثير 422 جفت باز از اينترون دو ژن لپتين و با استفاده ازآنزيم برشي Sau3AI، صورت پذيرفت. در نهايت روش سيليكا ژل روشي منلسب، مقرون صرفه براي استخراجDNA براي سلولهاي مختلف پيشنهاد مي گردد.
كلمات كليدي: استخراج DNA، روش جوشاندن، روش فنل كلروفورم، ماركرهاي مولكولي

مقدمه:
‌ ‌‌‌‌نقطهِ شروع‌ بسياري‌ از روشهاي‌ بيولوژي‌ مولكولي‌، ضرورت‌ جداسازيDNAبا كيفيت‌ عالي است. معمولا كيفيتDNA‌ با عواملي‌ از قبيل‌ عدم‌ آلودگي‌ ناشي‌ ازRNA، پروتئين، ليپيد و سايرساختارهائي‌ كه‌ براي‌ آنزيمهاي‌ برشي‌ و پلي‌ مرازها مزاحمت‌ ايجاد مي‌كنند سنجيده‌ مي‌شود.(1و4) به‌علت‌ بزرگ‌ بودن‌ اندازهِ DNA ژنومي‌ در پستانداران، روشهاي‌ استخراج DNA‌ بايد حداقل‌ استرس‌مكانيكي‌ را در طي‌ استخراج‌ ايجاد نمايند. ‌‌‌‌معمولإ روشهائي‌ كه‌ در آنها چندين‌ شوينده‌ همچونSDS‌ و‏TritonX100 استفاده‌ مي‌شود،كه‌ نقش‌ آنها ليز نمودن‌ سلول‌ و كمك‌ به‌ از بين‌ بردن‌ پروتئين‌ متصل‌ بهDNA‌ مي‌باشد. پروتئين‌زدائي ‌بيشتر از طريق‌ پروتيئنازK صورت‌ مي‌گيرد كه‌ اين‌ ماده‌ در بافر ليز كننده‌ مورد استفاده‌ قرار مي‌گيرد(4). اين‌ آنزيم‌ در حضورSDS در دمايc‌56-65فعاليت‌ دارد تحت‌ اين‌ شرايط‌ پروتئين‌ بهتر واسرشت‌ مي‌شود برعكس‌ در همين‌ شرايط‌ آنزيمهاي‌ ديگر مثلDNAase‌ دناتوره‌ مي‌شود.‌‌‌‌متعاقب‌ استفاده‌ از پروتيئنازK از ايزوپروپانول‌ براي‌ از بين‌ بردن‌ موِثر پروتئين‌ها استفاده مي‌شود و باقيمانده‌ پروتئين‌ و ليپيد نيز بطور موِثر از طريق‌ كا ربرد فنل‌ و كلروفورم‌ از بين‌ مي‌رودآلودگيRNA‌ از طريق‌ تيمار كردن‌ نمونه‌ با RNAase از بين‌ مي‌رود.‌‌ ‌‌در روشهاي‌ ديگر بعد از پروتئينازK از نمك‌ اشباع‌ براي‌ رفع‌ آلودگي‌ پروتئين‌ استفاده‌ مي‌شود در استخراجDNA ‌ از هپارين‌ برايPCR ‌ بهتر است‌ استفاده‌ نشود چون‌ هپارين‌ از فعاليتTaq ‌ پلي‌مراز جلوگيري‌ مي‌كند .‌‌‌‌وجودEDTA حداقلmM ‌2در بافر استخراج‌ باعث‌ مي‌شود كه‌ كوانزيمهاي‌ آنزيمAase‌DN‌با EDTA شلات‌ شود و از تجزيه‌ تصادفيDNA‌ جلوگيري‌ نمايد(1و4و5)
. دستورالعمل‌ استخراجDNA ‌ با پشتوانه‌اي‌ از دانش‌ بيوشيمي‌ همراه‌ است‌ و نبايد صرفا استفاده‌ از چند ماده‌ انگاشته‌ شود، درك‌ عملكرد هر ماده‌ اين‌ امكان‌ را فراهم‌ خواهد نمود كه‌ درصورت‌ نبود يك‌ ماده‌ از ماده‌ ديگري‌ با كار مشابه‌ استفاده‌ كرد. در اين‌ تحقيق‌ از‌ روشهاي‌ استخراج‌DNA استفاده‌ گرديد كه‌ در زير به‌ جزئيات‌ آنها اشاره‌ مي‌شود.
مواد و روشها
نمونه هاي خون اسپرم ، شير ، ريشه مو از گاوهاي بومي وگاوميش جمع آوري گرديد. خونگيري در گاوهاي بزرگ از وريد دمي ودر گوساله ها از وريدوداج صورت گرفت. سپس نمونه ها از مزرعه داخل لوله هاي حاوي خلا و EDTA همراه با يخ به آزمايشگاه اصلاح نباتات مولكولي دانشگاه تبريز گرديد و تا زمان استخراج در 20 درجه سانتيگراد نگهداري گرديد.
تخليص DNA
در اين تحقيق، تخليصDNA برروي اسپرم ، گلبولهاي سفيد خون ، شير و ريشه مو انجام پذيرفت .

روش جوشاندن
ابتدا 5/0 سي سي خون در تيوبهاي 5/1 ميلي ليتر كه فاقد هرگونه آلودگي مي باشد ريخته و به ميزان يك ميلي ليتر بافر R(mM10 تريس 5/7 =pH ،mM 33/0 ساكاروز ،mM 10 كلريد منيزيم و1% تريتون 100X ) اضافه و خوب آن را مخلوط و به مدت دو دقيقه با سرعت g1000 سانتريفوژ مي كنيم سپس محلول روئي دور ريخته و مراحل را آنقدر ادامه مي دهيم تا رسوب سفيد رنگ شود. سپس 100 ميكروليتر محلول (mM 50 هيدروكسيد سديم ) اضافه و به مدت 20 دقيقه در آب حوش قرار داده مي شود ، تا گلبولهاي سفيد ليز شوند بعد از آن 20 ميكروليتر محلول (mM 1بازتريس 5/7 = pH ) اضافه و بعد از سانتريفوژ كردن به مدت 30 ثانيه در g1000 محلول روئي را در تيوب جديد منتقل وتا زمان انجام آزمايشها در 20 – درجه سانتيگراد نگهداري مي شود(3).
تخليص DNA به روش Salting out
ابتدا گلبولهاي قرمز توسط بافر R ليز شده و گلبولهاي سفيد رسوب داده مي شود. سپس 300 ميكرو ليتر بافر هضم كننده(mM 10بازتريس، EDAT، mM20، M44/0 كلريد سديم) اضافه و سپس 20 ميكروليترٍSDS (10%) به تيوب اضافه مي كنيم و بعد 5 ميكروليتر پروتئينازK (20 ميليگرم در ميلي ليتر) به تيوب مربوطه اضافه مي كنيم . تيوپ مربوط را در دماي 55 درجه به مدت 2 ساعت يا در دماي 37 درجه سانتيگراد به مدت يك شب قرار داده تا عمل هضم سلولي بخوبي صورت گيرد.100 ميكروليتر محلولNaCl اضافه مي كنيم و10 الي30 دقيقه در يخ يا فريزر20 – قرار مي دهيم. سپس سانتريفوژ با سرعت g13000 صورت مي گيرد. جهت شستشوي رسوب مقدار اتانول 70% به ميزان 5/0 ميلي ليتر اضافه گرديده و با دور g13000 در دماي 4 درجه به مدت 5 دقيقه سانتريفوژ صورت گرفت. بعد از خشك شدن رسوب DNA مقدار 100 ميكروليتر TE (mM1EDTA، 8 pH ، mM10 بازتريس 6/7 pH ) جهت حل شدن آن اضافه گرديده و سپس نمونه ها در20 – درجه سانتيگراد به منظور بررسي مولكولي نگهداري مي شود(4) .
تخليص DNA به روش تيوسولفات گوانيدين - سيليكاژل
شيرحاوي انواع مختلفي از سلولها مي باشد كه در مجموع سلولهاي سوماتيك(Somatic Cell) ناميده مي شود . در شير به طور معمول سلولهاي نوتروفيل، ماكروفاژ، لنفوسيت و ائوزينوفيل وسلولهاي اپتليال وجود دارد. به لحاظ وجود حساسيت شديد گاوهاي بومي كشور و خوي نا آرام آنها كه همواره عمليات خونگيري را دچار مشكل كرده است ، دستيابي به DNA ژنومي از نمونه هاي شير راه كم خطر و مناسبي به نظر مي رسد.10 ميلي ليتر نمونه شير در داخل لوله هاي آزمايش درب دار حاوي فرمالدئيد جمع آوري گرديد و براي استخراج سانتريفوژ g10000 به مدت 10 دقيقه صورت پذيرفت و محلول روئي دور ريخته شد. سپس رسوب باقي مانده با محلول سالين شستشو داده شد . بقيه مراحل طبق روش تيوسولفات گوانيدين- سيليكاژل انجام پذيرفت. 500 ميكروليتر بافر هضم كننده (M5 تيوسيونالات گوانيدن،mM 20EDTA،mM40 Tris،40 گرم ,TritonX10010 گرم DTT ) به نمونه شير اضافه شده، نمونه ها به مدت 5 دقيقه در بن ما ري حاوي 65 درجه سانتيگرا د قرار گرفت. سپس 20 ميكروليتر محلول نوكلئاز(4 گرم ذرات سيليكا،100 ميكروليترگوانيدين) اضافه شد و به مدت 10 دقيقه به آرامي ورتكس گرديد. سپس به محيط همگن شده، 400 ميكرو ليتر بافرسالين EDTA 20mM , Tris-HCl 10mM , KCl 1M , NaCl 1M ) ) اضافه و در نهايت از طريق ماده Extra Gene (10% رزين 02/0 % ماده رنگي OrangG،01/0 درصدTriton X 100 ) ، DNA زرد رنگ از ساير ناخالصيها جدا گرديد(2) .
استخراج DNA از اسپرم و ريشه مو
استخراج DNA از پايتهاي اسپرم با روشهاي متداول ذكر شده امكان پذير است، اما به جهت اينكه اسپرم مقدار زيادي كلسترول و نمك دارد، با استفاده از بافر ٍٍPBS، مقادير كلسترول و نمك از رسوب شستشو مي شود و سپس از روشهاي ذكر شده مي توان در ادامه استخراج استفاده نمود. در مورد ريشه مو قبل از استفاده از روشهاي ذكر شده بايد ريشه هاي مو با اتانل 70 % چربي زدائي شوند. سپس در روي يك كاغذ صافي در 65 درجه خشك شود. سپس 5/0 سانتيمتر از قسمتي كه حاوي ريشه هاي موي است با قيچي جدا مي كنيم و در داخل تيوپ حاوي 100 ميكروليتر بافرA (200mM ، NaoH و DTT 50 mM ) قرار مي دهيم و 15 دقيقه در دماي 97 درجه سانتيگراد حرارت مي دهيم و سپس ساير مراحل را طبق روشهاي ذكر شده انجام مي دهيم .
آغازگرها
براي موفقيت و دقيق بودن واكنش زنجيره پلي مراز ، آغاز گرها از ويژگي خاصي بايد برخوردار باشند. آغازگرتصادفي مورد استفاده براي واكنش RAPD، OPU13 خريراري شده از شركت Operon بود .و براي انجام تكنيك PCR-RFLP از پرايمرهاي اختصاصي براي تكثير بخشي از اينترون ژن لپتين استفاده شد. اين دوجفت24 mer بودند كه ناحيه اي از اينترون دو ژن لپتين گاوي را تكثير مي سازد ساخت پرايمرها دوم توسط شركت روسي SYNTOL صورت پذيرفت. توالي مورد تكثيردر ژن بانك(EMBL) با شماره Y11369.1 موجود است.
واكنش زنجيره‌اي پليمراز
مواد وغلظت مناسب براي 25 ميكروليتر واكنش تهيه گرديد. انجامPCR با استفاده از كيتGenepak PCR Universal صورت گرفت. از مزاياي اين كيت اينست كه آنزيم Taq DNA پلي مراز به كمك آنتي بادي مهار شده است وتنها در درجه حرارت بالا ( بالاي 90 درجه ) اين آنتي بادي تخريب شده و آنزيم را رها مي نمايد لذا PCR به صورت Hot-Star انجام مي گيرد. به تمام ميكروتيوپها 10 ميكروليترPCR Diluent اضافه مي كنيم و ميزان غلظت آغاز گرهاي مورد استفاده 20-10 پيكومول مي باشد واكنش زنجيره پلي مراز براي تكثير ژن لپتين در ترموسايكر با برنامه (دناتوره شدن اوليه 93 درجه سانتيگراد، به مدت 2 دقيقه، دماي اتصال 55 درجه به مدت يك دقيقه، دماي تكثير 72 درجه به مدت1 دقيقه ، دماي دناتوره شدن 93 درجه سانتيگراد، به مدت 1 دقيقه، دماي تكثير نهائي 72 درجه سانتيگراد به مدت 3 دقيقه ) با 33 سيكل انجام پذيرفت .براي واكنش PCR-RAPD ازبرنامه حرارتي، 94 درجه به مدت 2 دقيقه،94 درجه به مدت 30 ثانيه، 45 درجه به مدت 30 ثانيه، 72 درجه به مدرت 30 ثانيه و بسط نهايي 72 درجه به مدت 10 دقيقه در 45 سيكل استفاده گرديد.
هضم آنزيمي
عمل هضم آنزيمي در حجم 30 ميكروليتر با مصرف 15 واحد آنزيمي تحت شرايط بافري و دماي مناسب با استفاده از آنزيم برشي Sau3AI كه سايت برشي GATC را شناسايي مي كند صورت پذيرفت
الكتروفوز محصولات PCR و هضم
ابتدا آگارز 8/1 % با بكار گيري بافرTBE 1 ، ./09mM تريس ، ./09mM اسيد بوريك و EDTA./02mM ) تهيه و به ازاي هر10 ميلي ليتر ژل 2/0 ميكرو ليتر اتيديوم برومايد (10mg/ml) به آن اضافه كرده و در ظرف مخصوص حاوي شانه ريخته مي شود.بعد از بسته شدن ژل، به ازاي 7 ميكروليتر محصول ‍PCR با دوميكروليتر لودينگ بافر( بروموفنل بلو 25/0 درصد، ساكارز40 % ) مخلوط نموده سپس در چاهكهاي ژل قرار داده مي شوند . با ولتاژ بالا حدود 100 ولت شروع تا اينكه نمونه ها از چاهك خارج شود سپس ولتاژ را به حدود 70 ولت رسانيده و سپس از يكساعت الكتروفورز نمونه ها با استفاده از دستگاه نور ماورا بنفش مورد بررسي قرار مي گيرند

بحث:
جدول1- مقايسه روشهاي مختلف استخراج DNA از بافتهاي حيواني (1و2و3و4)

نتايج نشان داد كه كيفيت و كميت DNA حاصله و روش سيليكا ژل و Salting out بهتر ومطلوبتر از روش جوشاندن است و از نظرفيزيكي نيزكمتر باعث فرسودگي DNA ميشود. روش جوشاندن باعث ايجاد DNA بصورت اسمير و حاوي پروتئين زياد مي شود غلظت DNA حاصله در روش جوشاندن 140-190mg/ml و در روش Salting out و سيلكاژل 400μg/ml محاسبه شد.
يك قطعه bp 422 از ژن لپتين كه شامل اينترون مي شد توسط PCR تكثيرگرديد و براي هضم آنزيمي از sau3AI استفاده شد.روش گوانيدين –تيوسولفات روش مناسبي است كه در آن ذارت سيليكون به جاي فنل و پرو پانل در رسوب دادنDNA از مخلوط ليز سلولها مي باشد. در اين روش در حضورغلظت بالاي نمك سيليكا به رشته هاي DNA چسبيده و آنها را رسوب مي دهند و در حضور غلظتهاي پايين نمك آن را رها مي كنند و بنابراين از اين خاصيت مي توان به جاي رسوب دادن اتانل يا ايزوپروپانل از اين ذرات استفاده كرد. از مزاياي ديگر اين كيت اينست كه در مرحله نهايي DNA در فاز زرد رنگ قرار مي گيرد و در نتيجه به آساني قابل جا شدن از ساير ناخالصيهاي نامطلوب مي باشد. از اين روش مي توان از خون كهنه و يا حتي لخته شده نيز براي استخراج استفاده كرد.

Refernce:
1.Berthomieu P and Meyer C (1991) Direct amplification of plant genomic DNA from leaf and root pieces using PCR. Plant Mol Biol 17: 555–557.
2.Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheim-Van Dillen, P.M.E. & Van Der Noordaa, J. 1989. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology., 28(3) : 495-503.
3.Chikuni, K., Y. Fukumoto, R. Tanabe and S. Muroya S.1997. Simple method for genotyping the bovine growth hormon gene. Animal Genetic 28: 230-232
4.Jeanpierre, M.1987. A rapid method for the purification of DNA from blood. Nucleic Acid. Research. 15(22): 9611.
5.Merante, F., S. Raha and M. Ling. Isolation of total cellular DNA from tissue and cultured cells. In: Rapley, R. and J. M. Walker.1999. Molecular Biomethods Handbook. Humana press Inc, Totowa.
6.Reymond, C. D. 1987. A. rapid for the preparation of multiple samples of ucaryotic DNA. Nucleic Acid.PP238
7.Tomas HT and Tanksley SD (1989) A rapid and inexpensive method for isolation of total DNA from dehydrated plant tissue. Plant Mol Biol Rep 12: 106–109.