چكيده:
از جمله عمده ترين مسائل جهاني در ارتباط با بازاريابي، فروش و صادرات گوشت، همانا كيفيت گوشت توليدي و مطابق با ذائقه هاي مختلف مصرف كننندگان مي باشد. در قرن اخير، صنعت پرورش و توليد حيوانات گوشتي به سوي توليد گوشت بدون چربي، توليد بيشتر و نتيجناً افزايش گوشتهاي مطبوع و حاوي تردي كافي حركت مي كند. گوشت حيوان نر از ارزش اقتصادي بالاتري نسبت به حيوان ماده برخوردار است چرا كه حيوانات ماده عمدتا به منظور توليد مثل نگهداري مي شود و طبيعاً ذبح آنها زماني صورت مي پذيرد كه به سن پيري رسيده باشند. موضوع پژوهش زير استفاده از تكنيك تعيين جنسيت قطعات گوشت عرضه شده در قصابي ها و بررسي صحت و سقم ادعاي آن نسبت به فروش گوشت حيوان نر به مشتري مي باشد. نمونه هاي قطعات گوشت از 10 مغازه قصابي در سطح استان (سه نمونه از هر مغازه) به طور تصادفي اخذ گرديده و استخراج DNA به کمک روش Boom (1989) و واكنش زنجيره پلي مراز (PCR) در ابتدا براي تكثير قطعه اي از ژن لپتين (كنترل) و سپس جهت تكثير قطعه 307 جفت بازي از ناحيه اي از كروموزوم Y به نام لوكوس BRY1 گاوي انجام گرفت. نتايج حاصل از بررسي نشان داد كه در بيشتر موارد عرضه كنندگان گوشت از صداقت لازم با مشتري برخوردار نبوده و از فروش گوشت حيوان جوان و نر شانه خالي مي كنند.
كلمات كليدي: تعيين جنسيت لاشه، كيفيت گوشت، تقلب در فروش
مقدمه:
از جمله عمده ترين مسائل جهاني در ارتباط با بازاريابي، فروش و صادرات گوشت، همانا كيفيت گوشت توليدي و مطابق با ذائقه هاي مختلف مصرف كننندگان، مي باشد. در قرن اخير، صنعت پرورش و توليد حيوانات گوشتي به سوي توليد گوشت بدون چربي، توليد بيشتر و نتيجتاً افزايش گوشتهاي مطبوع و حاوي تردي كافي، حركت مي كند. امروز توجه به تردي گوشت(Meat tenderness) از مواردي است كه همواره شركتهاي تجاري جهاني را در يافتن راهكارهاي مناسب در جهت ارتقا كيفيت اين پارامتر، به رقابت واداشته است. از مشكلات كنوني در اين رابط، فقدان روش طبقه بندي صحيح لاشه، بر اساس تردي نهايي گوشت مي باشد. روشهاي پيشنهادي اخير نظير سيستم طبقه بندي USDA به ميزان كافي در پيش بيني تردي گوشت كارآئي ندارند و بنابراين نياز به روشهايي جديد كه بتواند گوشت را از لحاظ تردي رتبه بندي نمايند، همواره احساس شده است. بكارگيري روشهاي ابداعي جديد در كنار روشهاي سنتي قبلي و معمول رتبه بندي گوشت، قطعا در بهبود كيفيت و تردي گوشت موثر واقع خواهند گرديد. از جمله پارامترهايي كه قبل از ذبح دامهاي اهلي، بر تردي و كيفيت گوشت موثر مي باشد، مي توان به تغديه، استرس، ژنتيك، جنس، مديريت اشاره كرد و از جمله فاكتورهايي كه پس از ذبح حيوان با تردي و كيفيت گوشت نهايي مرتبط هستند، مي توان زمان پيري پس از جمود نعشي، تحريك پذيري الكتريكي ماهيچه، pH ، لرزش ماهيچه در موقع ذبح، مقدار رگ وپي، دفعات انجماد و ذوب گوشت و بالاخره روشهاي پخت گوشت را نام برد. در تهيه خوراك كباب كه مطلوب ذائقه هر ايراني است كيفيت گوشت خريداري شده از اهميت عمده اي برخوردار است. معمولا گوشت دام نر از ارزش اقتصادي بالاتري نسبت به دام ماده برخوردار است چرا كه دام ماده به منظور توليد مثل پرورش داده مي شود و طبيعتا ذبح آن در 7 الي 8 سالگي صورت مي پذيرد يعني زماني كه ضخامت فيبرهاي ماهيچه اي افزايش يافته و سطح كلاژن بالايي را برخورد دار مي باشد. موضوع مطالعه فوق استفاده از تكنيك ساده براي تعيين جنسيت قطعات گوشت عرضه شده در قصابيها و ارزيابي صحت و سقم فروشنده مبني بر نر جنس حيوان ذبح شده مي باشد.
مواد و روشها:
نمونه گيري
تعداد 30 قطعه گوشت متعلق به ده مغازه عرضه گوشت در سطح استان بطور تصادفي انتخاب و اقدام به بيوپسي گرديد. نمونه ها در فلاسك حاوي يخ در همان روز به آزمايشگاه انتقال داده شد و كاملا و به طور مجزا چرخ گرديد و سپس با استفاده از ازت مايع پودر شد و 200 ميلي گرم از هر نمونه توزين و به داخل تيوپ اپندروف منتقل و پس از شمارگذاري آماده استخراج شد.
استخراج DNA: استخراج DNA از نمونه ها با استفاده از روشBoom و همکاران (1989) با استفاده از کيت Diatom انجام گرفت. اين روش مبتني براستفاده از ماده ليز کننده گوانيدين تيوسيانات و جذب کننده سيليکاژل مي باشد. بدين منظور ابتدا 200 ميکروليتر از خون برداشته سپس 500 ميكروليتر بافر هضم كننده (M5 گوانيدين تيوسيانات،mM 20EDTA،mM40 Tris،40 گرم TritonX100، 10 گرم DTT ) به نمونه اضافه شده، نمونه ها به مدت 5 دقيقه در بن ما ري حاوي 65 درجه سانتيگراد انکوبه گرديدند. سپس 20 ميكروليتر محلول نوكلئاز (4 گرم ذرات سيليكا،100 ميكروليترگوانيدين) اضافه شد و به مدت 10 دقيقه به آرامي ورتكس گرديد. سپس به محيط همگن شده، 400 ميكرو ليتر بافرسالين( EDTA 20mM , Tris-HCl 10mM , KCl 1M , NaCl 1M )اضافه و در نهايت از طريق ماده Extra Gene (10% رزين 02/0 % ماده رنگي OrangG، 01 /0 درصدTriton X 100 )، DNA زرد رنگ از ساير ناخالصيها جدا گرديد. جهت تعيين غلظت نمونه هاي استخراج DNA شده، از روش الکتروفورز مقايسه اي آگارز با استفاده از مقادير مشخصي DNA فاژ لامبدا و الکتروفورز استفاده گرديد.
انتخاب آغازگرها: آغازگرهاي اين مقاله توسط از تحقيق Matthew و همكاران (1990) انتخاب و آغازگرها دوجفت27 نوکلئوتيدي بودند كه قطعه اي بطول 307 جفت باز از ناحيه Male specific region به نام لوكوس BRY1 گاوي را تكثير مي نمايند. اين قطعه در فرد گاو نر قابل تكثير و در فرد ماده وجود ندارد.
Forward primer:
-GGATCCGAGAGACACAGAACAGGCTGC
Reverse primer
- TGATCAAGCTAATCCATCCATCCTAT
واكنش زنجيره‌اي پليمراز(PCR)
انجام واکنش زنجيره اي پليمراز به کمک کيت ليوفيلزه PCR Universal (Iso Gene–Moscow) که حاوي Mix، PCR Diluent و Mineral Oil بود بروش استاندارد انجام گرفت. غلظت نهايي مواد در 25 ميکروليتر عبارت بودند از: يک واحد آنزيم Taq Polymerase، 200 ميکرومول از هر dNTP، 200 ميلي مول MgCl2 ، 20-10 پيکامول مخلوط پرايمرها، 100-50 نانوگرم DNA و بافر استاندارد. واکنش PCR با برنامه حرارتي زير به تعداد 35 سيکل در دستگاه ترموسايکلر (UNIOII) انجام شد. برنامه حرارتي عبارت بود از: 90 درجه سانتيگراد جهت واسرشته شدن DNA بمدت 60 ثانيه، دماي 58 درجه سانتيگراد جهت اتصال پرايمرها بمدت 30 ثانيه و دماي 72 درجه سانتيگراد جهت سنتز بمدت 1 دقيقه.
الكتروفورز:
جهت مشاهده محصولات PCR از ژل آگارز 8/1 % و ولتاژ 100-70 ولت بمدت 2 ساعت استفاده شد. رنگ آميزي ژل با اتيديوم برومايد (mg/ml 10) انجام گرفت. قطعه تکثير شده زير لامپ UV با طول موج 230 نانومتر مشاهده و عکسبرداري توسط دستگاه مدل Biometra صورت گرفت.
نتايج:
استفاده از روش Boom و همکاران(1989) براي استخراج DNA از نمونه گوشت برتري خوبي را در استحصال DNA نشان داد(شکل 1).
شكل شماره 1: كميت و كيفيت DNA تخليص شده از گوشت

شكل شماره2: قطعه307 جفت باز تکثير شده از لوكوس BRY1 بوسيله PCR بهمراه مارکرbp M50

جدول 1: تعداد نمونه هاي اخذ شده از قصابي هاي مختلف و نتايج بررسي

بحث :
نتايج آزمايش نشان داد كه در بعضي موارد فروشندگان گوشت از صداقت لازم با مشتريان برخوردار نمي باشند و تقلب در گوشت هميشه از مشكلات خريداران مي باشد از كل نمونه هاي بررسي 35 درصد گوشت نر و بقيه گوشت ماده تشخيص داده شد.
 

REFERENCES

ENNIS, S.; GALLAGHER, T. F. A PCR-based sex-determination assay in cattle based on the bovine amelogenin locus. Animal Genetics, v. 25, n. 6, p. 425-427, 1994.

FUJISHIRO, A. et al. A fast convenient diagnosis of the bovine freemartin syndrome using polymerase chain reaction. Theriogenology, v. 43, n. 5, p. 883-891, 1995.

ITAGAKI Y. Sexing of bovine embryos with male-specific repetitive DNA by polymerase chain reaction: sexing of bovine embryos and production of calves with predicted sex. Journal of Reproduction Development, v. 39, n.1, p. 65-72, 1993. JAFAR, S. I.; FLINT, A. P. F. Use of polymerase chain reaction for sexing red deer (Cervus elaphus) blastocysts. Animal Biotechnology, v. 6, n. 2, p. 111-116, 1995.

SAMBROOCK, J.; FRITSCH, E. f.; MANIATIS, T. Molecular cloning: a laboratory manual. Nova York: Cold Spring Harbor, 1989. v. 1.

SCHLEE, P. et al. Growth hormone and insulin-like growth factor I concentrations in bulls of various growth hormone genotypes. Theoretical and Applied Genetics, v. 88, p. 497-500, 1994.
 

Prevention of butchers fraud in meat sale by bovine carcass sex determination
Arash Javanmard, Ali Javadmansh
West and North West of Agriculture Biotechnology Research center. Tabriz. IRAN
Department of Animal Science, Fardosi university, Mashad
E-mail: Javanmard@azaran.org.ir
 

Beef from male animals is commercially more valuable than beef from female animals, because females are used for reproduction and are normally slaughtered only when older, when the length and rigidity of muscle fibers is increased and the level of collagen is higher resulting in tougher meat of lower quality and thus lower commercial value. Many meatpacking plants sell cows meat as male meat, causing damage to various meat producing sectors and to consumers. The objective of the study reported in this paper was to develop a technique that would permit the sexing of boned, packaged and chilled, ready for sale beef. The principle of the technique is the same as used for sexing preimplanted cattle embryos, and depends on the fact that males and females can be differentiated by polymerase chain reaction (PCR) amplification of a male-specific region of chromosome Y using a sexually neutral region as an internal control. The State of East Azarbyjan province with the help of representatives of the butchers union. The amplified male-specific DNA region was the BRY1 region 1 of 307 bp. Genomic DNA was extracted by the silica gel kit. At the end of the DNA extraction procedure DNA was quantified in a spectrophotometer at 260 and 280 nm and its integrity was determined on 0.8% agarose minigel. The DNA samples were stored at 4oC in 1.5 ml Eppendorf tubes. We analyzed 40 samples identified as belonging to males, 9 of which (30%) presented a discordant result, i.e., they actually belonged to females. This method was a cheap and efficient technique for the determination of cattle sex from the carcass. It is technically simple and rapid, permitting its utilization in the prevention of fraud in the commercialization of beef.
Key words:( meat quality, BRY, PCR,Eeast Azarbyjan)